內標，在生物樣品分析中扮演著重要的角色：補償待測分析物在樣品處理和檢測過程中的變異。選擇合適的內標，對生物分析結果的準確性起著至關重要的作用。同時，內標響應的變異也提示著生物分析過程中可能存在的各種問題。本文將從內標的選擇和內標變異的影響分析，聊聊LC-MS/MS法生物分析中關于內標的那些事兒！

合適的內標，一般具備以下特征：

1、與待測分析物具有相似的理化性質、相近的色譜保留；

2、與待測分析物或可能的干擾物具有足夠的質譜分離度。

常見的內標有：穩定同位素內標（SIL-IS）和結構類似物內標。

穩定同位素內標：

應該與待測物具有足夠的分子質量差異，避免由于同位素分布造成的交叉干擾，如，內標的分子量最好比待測物分子量高1%或者4~5個質量單位；

同位素的標記位置應該穩定，避免在處理和檢測過程中發生同位素交換而造成干擾。

結構類似物內標：

最好與待測分析物具有相同的關鍵化學結構和官能團，相似的分子大小和理化性質（LogD值和PKa等）。結構和性質的差異，將導致提取回收率和離子化效率的差異。

內標可以在樣品處理、色譜分離和質譜檢測三個階段追蹤分析物，補償過程中產生的變異。因此內標加入的時間，越早越好，一般是在樣品處理時加樣后的第一步加入內標。

內標加入后需要充分混勻。

內標的加入量應考慮多個因素，如分析物和內標之間交叉干擾的大小，方法的靈敏度，基質效應的大小，內標預期濃度內的線性響應等。

一般情況下，建議使用較高的內標濃度，可以改善標準曲線的線性，并與高濃度樣品相匹配，減少分析未知樣品時潛在的系統誤差。

方法允許的情況下，建議使用相對大一點的加樣體積（50μL或者更多），保證加樣的精密度，同時肉眼可觀測到是否有內標加樣錯誤。

一般來說，內標對待測分析物的追蹤能力可以從標準曲線的線性度，準確度和精密度，回收率和基質效應的結果來評價。內標應與待測物具有相似的基質效應和回收率。

內標響應的波動是不可避免的，但是過大的波動可能預示著分析結果的可靠性和方法的有效性。因此在樣品分析過程中，需要對內標響應變異進行監控和檢查。常見的方法如下圖：

一般內標響應變異分為：

分散變異（個別變異）：

同一個分析批中一個或多個零散的樣品的內標響應顯著大于或小于其他樣品的內標響應，常見原因是樣品處理錯誤或者儀器錯誤造成，如內標加樣錯誤，進樣有氣泡等。

通常可以在SOP中規定未知樣品可接受的內標響應上下限（例如已知樣品響應均值的50%~150%），對于超限的個別樣品應進行復測。

系統性變異（趨勢性變異）：同一個分析批中，內標響應在某一段樣品中呈趨勢性降低或減少，或者部分樣品內標響應明顯低于或高于其他樣品，常見原因如樣品基質的特殊性造成干擾，系統問題造成響應飄移等。

系統性變異應進行全面的原因和影響分析。一般質控樣品在分析批中應該均勻散落分布，如果內標響應異常只出現在未知樣品中，通常是未知樣品相關的原因；

如果內標響應異常同時出現在已知樣品（校正和質控樣品）和未知樣品中，通常和樣品處理以及儀器設備故障相關。

內標響應變化的常見模式和原因，以及對分析結果準確度的影響如下：

如果內標加樣準確并且充分混合，之后樣品處理轉移過程中產生的誤差或不一致的進樣體積等原因引起內標響應波動，只要響應的靈敏度滿足要求，通常對測定結果沒有影響。

為進一步確認內標響應變異的影響，常見的處理方式有：

1、樣品重新分析

如果懷疑原因為系統未平衡好，在排除進樣器或者系統故障等原因后，待系統平衡好后將分析批重新進樣；

如果懷疑原因為樣品處理不當，如未混勻，移液器故障等，應重新處理這些樣品。

2、稀釋復測

對于僅僅是某一個或者某一批受試者樣品的內標響應變異大（受試者特殊基質差異或者代謝物、同服藥物干擾等原因造成），可以用已知樣品的空白基質對全部異常樣品或者選取不同濃度的樣品進行稀釋測定，應確保稀釋后的樣品內標響應與已知樣品一致。

如果稀釋后的測定結果與稀釋前結果一致（偏差在±20%以內），說明內標能夠很好的追蹤基質的影響，內標的變異對最終測定結果無明顯影響；

如果稀釋后的測定結果與稀釋前結果不一致（偏差大于±20%），需要進一步調查分析，可能最終會導致調整或重新開發分析方法；

但此方法的前提是，稀釋后的樣品濃度依然能夠在線性范圍內。

3、使用受試者基質配制質控樣品

如果原因是基質差異，也可以通過用空白的受試者基質（給藥前零點樣本）配制質控樣品，測定這些質控樣品的濃度。如果這些質控樣品與受試者采集的樣品內標響應一致，且這些質控樣品的測定結果準確度偏差在±15%以內，則可以認為基質差異造成的內標變異對最終結果沒有產生影響。

4、標準加入法

對于樣品濃度太低不能通過稀釋復測的方法進行調查的情況，可以考慮通過在這些樣品中加入不同濃度的待測分析物和同一濃度的內標進行處理分析。根據加入待測分析物的已知濃度和對應的響應繪制濃度-響應曲線，通過外推的截距計算樣品的濃度。

如果標準加入法測得的濃度與初始測定濃度一致，說明內標的變異對測定結果沒有影響。

此方法需要較多的待測樣品，而且需要消耗很多時間，對于樣本量大的樣品不太適用。

另外，如果內標響應波動大的樣品，在ISR中內標響應正常，并且測定結果與初始測定結果一致，也可以說明初始的內標變異沒有對測定結果產生影響。但是如果在方法學驗證過程中就已經發現內標響應波動較大，可能提示方法的耐用性還需要提高，還需要進一步優化系統或方法。

總之，內標在保證LC-MS/MS定量分析的準確和方法耐用性方面起著非常重要的作用。應盡可能選擇SIL-IS，特別是13C和15N標記的，因為這些內標可以抵消內標變異產生的很多影響，特別是基質差異造成的影響。樣品分析過程中，需要關注每個分析批的內標響應波動情況。同樣的變異趨勢可能由不同的原因造成，應充分調查分析內標變異的原因，必要時可對相應的樣品重新分析。有時即使內標響應異常，如果有證據表明內標依然能夠追蹤分析物，分析物/內標響應比值沒有受到影響，可以接受響應異常的結果。

參考來源：

1、Evaluation of Internal Standard Responses During Chromatographic Bioanalysis: Questions and Answers，FDA

2、Buonarati MH，Schoener D. Investigations beyond standard operating procedure on internal standard response[J]. Bioanalysis，2019，0187

3、Li WK，Zhang J，Francis L.S.Tse. Handbook of LC-MS Bioanalysis: Best Practices, Experimental Protocols，and Regulations，First Edition，John Wiley & Sons, Inc.

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