作者 魏敏吉 張玉琥 張哲峰   化藥藥學二部   

摘要：生物樣品分析是進行藥代動力學（PK）、生物利用度（BA）、生物等效性（BE）研究及藥代動力學（PK）/藥效動力學（PD）分析的基礎。本文針對目前申報資料中生物樣品分析準確性方面存在的問題，分析探討其產生的原因及改進措施，以期提高生物樣品分析的質量。
關鍵詞：生物樣品分析、藥代動力學、生物利用度、生物等效性、準確性
      生物樣品分析是指對來自動物或臨床的生物樣本中的藥物、代謝物、生物標志物的分析^[1]。本文探討的問題主要涉及來自臨床的血、尿樣品的分析，這些問題同樣也適用于臨床前動物血、尿樣品，以及來自動物和人體的其他樣品，如糞便、組織、細胞等。
一、來自審評員的困惑
      在藥品審評過程中，審評員經常會發現不符合常理的事情。如在真實性、方法學、測試批按照目前指導原則進行審評均不存在問題的前提下，就AUC均值而言，同一企業的藥品作為參比制劑（批號不同）在同一試驗單位測試，前后獲得的數據最大會相差6倍；同一企業的試驗藥品，同一批號、同一劑量，在兩個單位按照相同條件分別試驗和測試，提供的AUC均值數據相差近2倍。
二、什么原因造成這些問題
      以上個例所反映的情況為數據準確性的問題。究竟是那些因素導致了這些問題，解開這個謎團的最直接的方法是對出現問題的樣品重新進行分析，看看究竟是哪方面出現了問題，是標準品的問題、測試問題還是確實是受試者自身的差異造成的？但實際上，重復測定存在著很多困難，提交資料的單位有時早期并不知道數據的差異，待審評中心發現這個問題時，時間已經過去很久，保存的樣品不能確定是否還穩定，再分析失去了意義；另外，這其中還涉及到經費、方法重現等問題。因此，目前多數還無法知道其中的確切原因。
      藥代動力學、生物等效性研究的指導原則已經頒布多年^[2,3]，被國內單位所廣泛接受。在進行生物樣品測定時，首先應建立分析方法，并按照要求進行方法學考核，只有考核通過時，才能進行樣品測試。方法學考核時要求考察專屬性、線性、最低定量限、回收率、稀釋完整性（必要時）、基質效應、穩定性等。但要注意，在考核過程中，如果標準品純度有誤或未加校正、配制的母液濃度錯誤、天平或容器計量不準、使用與測試基質不同的空白生物樣品基質（如臨床上用的成份血漿做方法學考核的空白基質）、線性和質控樣配制不規范等，這些問題均不會影響方法學考核的通過和樣品測試結果批符合要求，但均可以造成準確度的巨大差異。
三、數據不準確會造成哪些問題
      準確的數據是一切分析的基礎，不準確的數據會產生嚴重的誤導作用，造成時間、金錢的浪費，甚至導致本可以上市的藥物被拒批。例如，對于濃度依賴性抗菌藥物，如果AUC測定不準確，則不能正確地通過AUC/MIC比值來確定最佳給藥劑量；再例如，注冊分類3藥品的PK橋接研究，在沒有國外人群作為參比的情況下，如果存在測定結果的不準確，則不易正確判斷種族差異的大小，無法橋接國外豐富的臨床研究數據。創新藥物的開發過程中，需要沿著安全有效、質量可控這條主線逐步推進，臨床前和臨床研究均需要為這一主線服務，各種數據互相佐證、形成證據鏈，最大可能地揭示藥物在體內的作用規律，支持新藥上市。而在這一過程中，大量未知因素摻雜其中。一般可通過固定可控因素，暴露不可控因素，尋找其中的規律。如果摻入數據不準確這一實際上可以控制的因素，除不利于原因分析外，還會誤導決策人和審評人，長期下去會嚴重阻礙新藥研究和評價質量的提高。
四、如何避免上述問題
（一）原因分析和策略
      出現以上準確性問題，其原因是多方面的，有的原因已知，有的原因未知。因此，采取的對策可以是針對性的，也可以是預防性的。依據作者經驗，建議如下策略，供申辦者和研究單位參考。
      1、參照藥物臨床試驗生物樣本分析實驗室管理指南（試行）的要求，對比本單位的不足并加以改進；建立和健全獨立運行的質保體系，使質保真正地在試驗前、試驗中、試驗后發揮作用，而不是走過場。
      2、生物樣品測試承擔單位應積極分析數據差異的原因，尤其是一個單位前后時間承擔了同一個項目時。獲得的數據要進行多方面對比，如與原研企業、國內外文獻、本單位以往獲得的結果進行對比，如出現了較大的差異，應積極分析其原因并加以克服，并在今后的試驗中避免再次發生。
      3、測試人員應相對固定，對人員流動比較大的單位，如一些高校單位、合同研究單位，承擔樣品分析的負責人要采取措施保證一個分析項目中測試人員相對穩定，且對加入的新人需要經過培訓、能力測試等措施后方可以安排其測試任務。
      4、對于樣品采集與測試不在一地進行或樣品轉移時間比較長時，申辦者或研究單位應有相應措施保證樣品在轉移過程的穩定并用數據說明。
      5、對于樣品分析跨度時間比較長或多個相關試驗同時或先后進行時，申辦者應采取措施保證不同時間、不同地點的試驗結果的一致性。一般情況下，不建議頻繁更換樣品測試單位，確實需要更換時，應進行實驗室比對試驗（樣品互測），確保試驗數據的一致性；使用不同的方法進行測定時，建議進行交叉驗證。
      6、由于測試單位提供的數據可以作為支持新藥上市的依據，承擔測試的試驗單位應確保當試驗數據與申辦者利益出現沖突時能夠處在公正立場，為數據質量負責，而不是為試驗結果負責，杜絕造假事件和提供虛假數據的發生。
（二）提高研究數據質量的經驗介紹
      1、儀器狀態：生物樣品分析需要極高的靈敏度和準確度，涉及的儀器，其狀態必須處于最佳狀態，且多數儀器需要計量認證，必要時還可以進行3Q認證（IQ/OQ/PQ）。
      2、對照品（標準品）：首選國家對照品（標準品）；對于從試劑公司購買、自制的對照品要保證批次之間的一致性，提供分析證書；一般情況下，不用自身制劑作為對照品。用對照品計算儲備液的濃度時，除含量折算外，還需注意是否需要扣去鹽基、水份。如用原料藥做對照品，原料藥檢驗報告中的含量，往往是以干品計，已經去掉了水份，而稱量時必須考慮到水份的影響。對照品開封后應盡快使用，避免吸潮和分解。對于開展周期比較長的臨床試驗，對照品的批次不要更換太頻，在保證穩定的情況下，盡量使用同一批對照品，這要求一次要購買或制備足夠量的對照品。
      3、計量容器的準確性：試驗中使用的各種計量容器要定期校準、專人專用，如開展一個新的試驗時，可以將要使用的計量容器全部重新校準一遍。稱量時要考慮天平的感量，如萬分之一天平適合稱量10mg以上的重量，1mg的重量需要百萬分之一天平稱量。
      4、考核用的生物基質應與樣品基質一致：與化學分析不同，生物樣品的分析必須考慮生物基質的影響，特別是目前使用LC-MS/MS越來越多的情況下。不同基質其離子化效率差別很大，需要在研究中保持生物基質的來源和含量一致，如成份血、動物血不能用來代替臨床受試者的血樣進行方法學考察，血清和血漿也不能互相替代，也不能用稀釋后的血漿代替正常人血漿。在不同來源血漿（清）的專屬性、基質效應等考察中要清楚地標明其來源。
      5、線性和質控樣配制的規范化問題：這也是目前出現問題比較多的地方，也可能是影響數據準確度的一個非常重要因素。方法學考核的目的是用含藥的血漿（清）來模擬實際樣品的情況，因此，模擬樣和待測樣的基質種類及其含量要嚴格一致。目前申報資料中，制備模擬樣主要有四種方法：①將一定體積的工作液加入到生物基質中，之后用生物基質進行稀釋獲得不同濃度的模擬樣，然后等份；②將貯備液稀釋成不同的濃度工作液，臨用時取同樣體積的工作液加入到生物基質中制備成不同濃度的線性和質控模擬樣，沒有等份；③將不同濃度的工作液加入到試管中吹干，然后再加入固定體積的生物基質，振搖使殘渣溶解；④將貯備液稀釋成不同濃度的工作液，取同樣體積的工作液加入到同樣體積的生物基質中制備成不同濃度的模擬樣，然后等份。以上幾種方法均有其優缺點，方法①需要注意加入溶劑的體積比例，第一個點一般應控制在5%以下，且不同濃度的模擬樣含有溶劑的比例是不一樣的，第一個點稀釋時溶劑含量最大。過多的溶劑，如甲醇，可以使蛋白變性，造成藥物被吸附或包裹，使整個濃度范圍出現誤差。方法②制備的模擬樣，現用現配時，待測物溶液中的成份和血漿（清）之間可能沒有達到平衡即被進入下一步處理，如沉淀或萃取，造成回收率結果虛高；進行生物樣品穩定性考察時，需要考慮終體積和溶劑比例。如樣品處理時，使用100μl血漿，則最好用等份的100μl血漿質控來進行模擬。如果質控樣用100μl血漿+20μl待測物溶液（溶劑含量16.7%，過高）來模擬，因實際生物樣品中并沒有這20μl溶劑，且終體積為120μl，使用這種模擬樣獲得的穩定性數據就不能代表實際樣的穩定性情況。另外，使用這種方法進行方法學考核和樣品測試時應保持嚴格的平行操作（臨床樣品需要補充同體積的溶劑）；方法③在吹干過程中有可能造成待測物損失，殘渣溶解得也可能不徹底。方法②、③均需要注意所制備的貯備液的穩定性。用同一個貯備液制備的線性和質控樣，即使貯備液的濃度發生很大變化，其線性和質控數據是不受影響的。方法④為比較規范的線性和質控樣品制備方法，注意控制溶劑含量在5%以內。方法①、④使用空白生物基質較多，方法②、③比較節省空白生物基質。另外，還應注意加入質控樣的目的是保證所建立的方法的可靠性，目前的指導原則只是推薦由不同人制備，從提高數據質量來看，應要求由不同人從稱量開始進行質控樣配制，這其中包括LLOQ樣的配制。配制的質控樣的濃度盡量與線性樣有區別，以提高質控樣的質控作用。配制的質控濃度QCL應在3倍的LLOQ濃度以內，QCM應在線性范圍的幾何或算術平均值的40~60%，QCH應為線性上限的75~90%。質控樣一次配制可以適當多些，不同批次的質控樣有時還需要在一個分析批內測定，以比較其濃度是否有明顯差異。
      6、內標和最低定量限問題：內標的濃度要兼顧待測物的含量高低，不能太高和太低，太高時造成峰面積比值很小，易受有效數字的影響；太低時易受基線噪音的影響，應保證S/N>20。專屬性考察時，不同來源生物樣品的干擾峰面積應小于LLOQ樣峰面積的20%。交叉干擾峰面積也應小于LLOQ樣峰面積的20%或保證S/N＞5。在進行最低定量限確定時，應考慮儀器使用過程中靈敏度下降的因素，S/N應留有一定的冗余度，以便即使靈敏度下降后其S/N值還能夠符合要求。內標選擇時，液質聯用方法推薦選擇高純度的穩定同位素標記的內標。
      7、系統適應性和研究者能力考核：每一批分析前推薦使用不同的樣品溶液進行系統適用性試驗。有的研究使用不含生物基質的LLOQ溶液；有的使用LLOQ、ULOQ、空白樣。主要目的是考核儀器的靈敏度、分離度、峰形、信噪比、噪音水平、交叉污染情況等。另外，參加樣品分析的研究者，即使經驗非常豐富， 在進行一個新的研究項目時，還是應該注意進行研究能力的考核。在審評時，對比研究者提交的前后分析數據，有時會發現，前幾批測試數據變異明顯高，后幾批逐漸趨于正常，其原因可能與早期研究者操作不熟練有關。
      8、轉移樣品的穩定性問題：目前開展的許多BE、PK試驗，樣品采集和測試在不同的單位進行。有時兩單位相距很遠，甚至將樣品送到國外測試。樣品轉移的時間數小時或數天不等。由于生物樣品的特殊性，在常溫下，有些成分會迅速降解，導致測試數據失真。在此種情況下，除了制定質保措施外，還需要用數據說明整個樣品在轉移過程中是穩定的。
      9、分析批序列：隨著高靈敏度儀器的使用，進樣之間的交叉污染成為一個重要的污染源，需要在方法學考核和測試中時刻進行控制，可以在分析批運行前和運行中進行考核。目前許多申報單位在進行方法學考核時將5或6個同濃度的質控樣一起測定，如先測6個QCL，再測6個QCM，之后再測6個QCH，這種做法交叉污染小，獲得數據的一致性會明顯很好，但該數據并不反映實際樣品批測試中交叉污染情況。正確的做法應是將不同濃度的質控樣品交叉進樣，從而在交叉污染存在的情況下，比較各個質控濃度點測試的準確度和精密度。必要時在方法學中進行殘留試驗考察，即在測試中，線性高濃度點進樣后，接著進一個空白樣，根據空白樣圖譜中殘留的大小確定所建方法的交叉污染是否合適。越來越多的研究顯示，交叉污染的大小是評價分析批質量的關鍵因素之一，在方法學考核時應作為一項指標加以考核 ^[4]。
      10、樣品復測：除了在一些規定的情況下對已分析的樣品進行復測外，有時要在分析計劃中做出規定，專門進行一定量的樣品復測。在實際分析中，研究者往往發現質控樣重復測定的一致性并不代表實際樣品的測定結果也是一致的。因此，在樣品測試中，對分析計劃規定的樣品進行復測，然后比較兩次測定的結果，可以驗證方法學的重復性情況。如果方法學確實可行，則應該可以獲得一致的重復測定結果。
      11、分析方法轉移后的再現、實驗室間比對：目前申辦者開展的一個新藥研發項目，測試部分往往安排在幾個單位進行，此時，有必要進行分析方法轉移后的再現考核。有時還需要進行實驗室間比對試驗，保證后一個實驗室的結果與前一個實驗室的結果具有一致性，這是目前臨床試驗中亟需加強的一項任務。
      12、交叉考核：當涉及兩種或以上方法進行測試時，有必要進行交叉考核，確保兩種方法測試數據的一致性^[5]。
      13、樣品采集的問題：生物樣品測定結果不準確的問題還可能來自樣品采集過程，涉及到試驗過程是否規范（盡量避免采血前受試者剛剛用完餐或大量飲水）、采樣時間是否準確、留置針采樣時是否去除了殘留血樣的污染、血漿或血清離心是否及時、有無溶血、是否避光操作、獲得的生物樣品是否及時凍存等；對于尿液涉及時間段和體積記錄是否準確、留樣前混合是否均勻、長時間段的尿樣是否冷藏保存等。
      14、參加實驗室之間考核：根據承擔的測試項目不同，一定時期內參加權威機構的盲樣測試，以評價該實驗室的測試水平，是一種較好的提高測試準確性的方法。但目前國內還缺乏此類機構，希望有關單位予以重視。
五、小結
      我國醫藥工業“十二五”發展規劃的主要任務中，增強新藥創制能力、提升藥品質量安全水平，均與臨床研究的數據質量有關系。應該重視申報數據的質量，并把此項工作當成提高臨床研究質量的大事來抓。如果各方面共同行動，相信分析測試的數據質量在未來不長時間內會有一個質的飛躍。近期頒布實施的藥物臨床試驗生物樣本分析實驗室管理指南（試行）^[1]，從設施、儀器、人員、規范化操作、質量保證體系方面做出了嚴格的規定，一定程度上會幫助數據準確性的提高。
      在創新藥物研發過程中，保持生物樣品測試的前后準確和一致性，是臨床試驗快速推進的保證。在此，提醒注冊申請人和試驗研究者在試驗過程中采取各種措施保證獲得的試驗數據質量，這對涉及跨年度、多地才能完成的臨床試驗尤為關鍵。在試驗過程中，對出現的問題及時分析和排除，最大限度、準確無誤地揭示藥物在人體內的作用規律，才能為藥物的安全性和有效性評價提供可靠支撐。
      國內相關指導原則頒布較早，在方法學考核及質量保證體系方面要求尚不完善，生物樣本分析時不能僅滿足于按照指導原則要求進行做作業式的考核，生物樣品分析的承擔單位應主動分析可能出現的各種各樣問題并加以驗證解決，為提高我國藥品研究水平和提高上市藥品質量做出應有的貢獻。

參考文獻
1.國家食品藥品監督管理局. 藥物臨床試驗生物樣本分析實驗室管理指南（試行）國食藥監注字[2011]482號
2.國家食品藥品監督管理局. 化學藥物臨床藥代動力學研究技術指導原則. 2005.
3.國家食品藥品監督管理局. 化學藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術指導原則.  2005.
4.European Medicines Agency. Guideline on validation of bioanalytical methods. www.ema.europa.eu/pdfs/human/ewp/19221709en.pdf. 2009.
5.U. S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine(CVM), Guidance for industry, Bioanalytical method validation. www.fda.gov/cvm. May 2001