生物等效性試驗的目標是通過體內試驗的方式對兩個制劑內在質量進行評價，因此生物等效性試驗本身的科學、客觀、規范性則顯得尤為重要。通常，需要通過試驗設計（如足夠的例數、交叉設計、受試者控制等）、對分析方法的質控、合理的數據處理等方式盡量降低試驗本身對評價結果的干擾，以期充分、客觀的反映兩種制劑之間的差異以及這種差異的臨床可接受性。
在過渡期品種集中審評中，生物等效性試驗所存在的問題較多，涉及到試驗的多個方面，很多問題直接影響到對生物等效性結果的評價，現對專家審評會議中發現的主要問題進行匯總如下：
一、試驗設計存在嚴重缺陷：
合理的試驗設計是試驗結果可評價性的基本保證。生物等效性試驗應根據藥品的特點，參照指導原則的基本要求進行設計：
1.受試者選擇和/或受試者例數應滿足試驗結果的評價要求。
2.應采用隨機分組，交叉設計。如采用平行組設計時應說明理由并同時關注受試者例數的相應變化。
3.采用交叉設計時，應有足夠的清洗期（一般應大于7個消除半衰期）。
4.受試制劑的處方工藝、生產規模應能代表大生產產品的質量。
5.參比制劑的選擇應符合《藥品注冊管理辦法》附件二，并按照臨床研究批件的要求選擇。
6.給藥劑量的選擇應有依據并符合臨床用藥的安全原則。
7.生物樣本采集時間點應科學、合理，以真實反映藥物的體內過程。
本次審評的生物等效性試驗中，試驗設計存在缺陷者具有相當的比例，具體如下：
1.參比制劑選擇不合理：如仿制復方制劑（或改劑型）而選擇單方為參比，且規格不同；未按批件要求選擇參比制劑等。
典型案例：
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品種 |
問題 |
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復方布洛芬軟膠囊 |
復方布洛芬軟膠囊，按注冊分類5申報，國內有復方布洛芬片上市，規格：布洛芬0.4g與對乙酰氨基酚0.325g，本品申報規格（1）布洛芬0.2g與對乙酰氨基酚0.1625g，（2）布洛芬0.4g與對乙酰氨基酚0.325g。本品生物等效性試驗參比制劑選擇單方布洛芬軟膠囊（200mg/粒）以及單方對乙酰氨基酚片（500mg/片），而未選擇已經上市的片劑，導致試驗結果無法說明新劑型與原劑型是否生物等效以及臨床是否具有可替換性。 |
2.取血時間設計不合理：如吸收相選點過少，導致第一個點就是Cmax；消除相取血點不夠，采樣時間不足3個半衰期，最后一個取樣點的血藥濃度過高，影響等效性評價。與此相關的還有可能是分析方法靈敏度不夠，延長取血時間后血藥濃度低于定量下限。
案例分析：
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品種 |
問題 |
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更昔洛韋分散片 |
本品生物等效性試驗設計中，取血點設計為服藥前（0小時）及服藥后0.33、0.67、1、2、3、4、5、7、9、12、15小時，從試驗結果看，試驗藥和參比制劑的半衰期分別為5.83±2.19和7.97±4.91，其取血時間不足3個半衰期，從第15個小時的血藥濃度看，80％的受試者血藥濃度大于Cmax的1/10，以此為基礎的等效性評價可靠性較差。 |
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消旋卡多曲分散片 |
本品取血點設計服藥前、服藥后5min、10min、15min、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、3h、4h、5h和6h。采用HPLC-UV方法測定消旋卡多曲的體內活性代謝物Thiorphan(TP)血漿濃度。線性范圍為50ng/ml-4000ng/ml，最低定量濃度為50ng/ml。原研廠說明書顯示，活性代謝產物的半衰期為3小時左右，本試驗結果半衰期也在1.6～2小時，而生物樣本取樣僅為6小時，且最后一點的血藥濃度除個別點外，均大于Cmax的1/10，試驗設計不合理。
本品分析方法的定量下限為0.05μg/ml，而本品試驗藥物和參比制劑的Cmax分別為0.611±0.166μg/ml、0.556±0.152μg/ml，有4例在最后一個取樣點已無法測到血藥濃度，本方法的靈敏度不能滿足生物樣本的檢測要求。 |
3.對內源性物質的考察：試驗設計中未對飲食等進行必要的控制，干擾檢測。
典型案例：
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品種 |
問題 |
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枸櫞酸鉀緩釋片 |
枸櫞酸鉀為內源性物質，在生物等效性研究中應對受試者的飲食、運動等嚴格控制，而本研究中對受試者缺少相應控制，導致在給藥前的飲食控制期受試者尿中枸櫞酸根排量變異很大，此外，幾乎所有PK參數變異都非常大。無法對本品的藥代動力學特點進行評價。 |
4.服藥方法不合理：主要為口腔崩解片、泡騰片、咀嚼片等未按臨床實際用藥方法服用。
典型案例：
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品種 |
問題 |
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鹽酸伐昔洛韋泡騰片 |
試驗設計存在嚴重缺陷，未按泡騰片劑型特點服藥，導致試驗結果無法評價。 |
5.清洗期不夠：主要存在于半衰期較長的藥，如半衰期過長，建議采用平行組設計。
二、分析方法存在嚴重問題：
生物樣本檢測方法的建立和驗證是生物等效性研究的重要內容之一。應參照指導原則中對方法學的相關要求開展相應的研究，并提供方法學驗證的資料。在多種方法可供選擇時，應使用更為穩定、專屬、靈敏的方法。
1.特異性研究：分析方法的特異性應能夠滿足測定要求。
2.精密度和準確度：分析方法的精密度和準確度應能滿足指導原則的最低要求，保證試驗結果的可靠性。
3.標準曲線和定量范圍：標準曲線高低濃度范圍為定量范圍，在定量范圍內濃度測定結果應達到試驗要求的精密度和準確度。
4.定量下限：分析方法的定量下限應滿足測定3～5 個消除半衰期時樣品中的藥物濃度或檢測出Cmax 的1／10～1／20 時的藥物濃度。
5.樣品穩定性：應根據具體情況，對含藥生物樣品在室溫、冰凍或凍融條件下以及不同存放時間進行穩定性考察，以確定生物樣品的存放條件和時間。還應注意考察儲備液的穩定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩定性，以保證檢測結果的準確性和重現性。
6.提取回收率：應考察高、中、低3 個濃度的提取回收率，其結果應當精密和可重現。
在過渡期品種集中審評中，方法學方面存在的問題最為突出，具體表現在以下幾個方面：
1）檢測物的選擇：在原型藥物半衰期較長且可檢測的情況下未檢測原型藥物，而僅檢測代謝物，增加了評價的可變因素。
典型案例：
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品種 |
問題 |
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復方別嘌醇分散片 |
生物等效性研究測定物為苯溴馬隆、別嘌醇的代謝產物氧別嘌呤醇。本試驗設計存在嚴重缺陷：本復方中所含別嘌醇，文獻報道其原型藥的半衰期約1.8小時，同品種試驗所得半衰期約為1小時，本試驗設計中僅測定代謝產物氧別嘌醇，不符合生物等效性試驗的要求。 |
2）檢測方法的特異性存在問題：本次集中審評的品種中，抗生素類藥物以微生物法進行血樣分析，由于無法分清原型藥與活性代謝產物，特異性存在問題而不能通過審評（同時微生物法的靈敏度、準確性也較其他方法誤差大）。
典型案例：
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品種 |
問題 |
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阿奇霉素膠囊
阿奇霉素分散片 |
生物等效性試驗采用微生物法，其方法的靈敏度、專屬性不能滿足生物樣本的檢測要求，導致試驗結果不可靠。 |
3）標準曲線與定量下限：如標準曲線上限過高，導致曲線斜率發生變化；定量下限過高，靈敏度差，導致后面的多個取血點不能檢出血藥濃度，分析方法不能滿足檢測要求。
典型案例：
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品種 |
問題 |
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消旋卡多曲分散片 |
見“取血時間設計不合理”案例分析 |
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更昔洛韋分散片 |
采用高效液相色譜紫外檢測法測定血漿樣品中的濃度，本方法的線性范圍是0.05-5.0ug/mL，定量下限為0.05ug/mL，而試驗制劑和參比制劑的Cmax分別為0.58±0.18和0.60±0.20，本檢測方法的靈敏度較差，僅能檢測到用藥后18小時，不足3個半衰期，因此其生物等效性試驗結果無法評價。 |
4）穩定性考察：雖然本次審評中沒有單純由于穩定性考察不全面或不規范而不批準的品種，但審評中發現穩定性考察存在問題較多，如考察時間不夠、樣本量不夠、方法不規范等。
典型案例：
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品種 |
問題 |
| 曲克蘆丁滴丸 |
生物等效性試驗中，穩定性考察為單樣本，不滿足要求；冷凍條件考察7天，與樣品檢測時間不相關；缺方法回收率結果。生物樣本檢測方法學驗證不充分，分析方法的可行性無法判斷。 |
5）方法學驗證問題：方法學驗證已經顯示該分析方法存在問題，但仍采用。
典型案例：
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品種 |
問題 |
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奧美拉唑腸溶片 |
本品生物等效性試驗，方法學驗證顯示，高濃度組日間變異已經超過15％，說明該方法的準確性較差，結果：試驗藥和參比制劑的Cmax(ng/ml)分別為1026.044±1707.210和953.364±1354.787，其SD遠大于均值，該分析方法不能滿足生物樣本檢測的要求。 |
三、 分析圖譜存在嚴重問題：
本次生物等效性審評要求申報單位提供20％受試者生物樣本檢測的圖譜和相應分析批的標準曲線和質控圖譜，從審評中發現圖譜存在以下主要問題：
1.缺少應該提供的圖譜：提供的圖譜缺少相應分析批的標準曲線和/或質控樣本的圖譜；有些品種提供的圖譜不是20％受試者兩個周期試驗的所有圖譜，而是40％受試者一個周期的圖譜。
2.所提供的圖譜不規范，無法溯源：有相當數量的品種提供的圖譜缺少必要的信息，如圖譜缺少明確標示（不清楚所對應的樣品）、進樣時間、修改時間、報告日期、峰面積的積分線、相應濃度等，導致試驗結果的真實性無法評價、原始數據無法溯源等。
3.所提供圖譜的真實性存在問題：突出表現為圖譜的后期制作（以office進行編輯）、一圖多用、進樣時間矛盾等。
四、 試驗結果無法評價：
對試驗制劑是否與參比制劑生物等效的評價應基于完整、可靠的試驗數據和正確的統計分析方法。應提供完整可靠的試驗數據，并采用正確的方法進行統計分析。
1. 提供的試驗數據的完整性：
1.1 應提供每個受試者、每個時間點的血藥濃度值（受試制劑和參比制劑）
1.2 應提供每一時間點的平均血藥濃度、標準差
1.3 提供每個受試者的血藥濃度－時間曲線、平均血藥濃度－時間曲線和各時間點的血藥濃度標準差
1.4 提供必要的藥代動力學參數：Cmax 、Tmax、AUC0→t、AUC0→∞
1.5 數據處理：對試驗所得數據處理應采用正確統計和分析方法。
2. 試驗結果的評價：
對生物等效性試驗的結果的評價，不但是整個試驗的結論，同時是對試驗制劑可否在臨床上替代參比制劑的評價，因此應滿足指導原則的相關要求。
對試驗結果的評價源于試驗數據的可靠性和完整性，本次審評中，試驗數據的問題有如下幾個方面：
1.試驗數據不完整：主要表現在對用藥前的取血點未進行檢測，而直接以0表示；對低于定量下限的數據計為實測值（或0），導致數據處理的偏差；缺少應該提供的藥代動力學參數等。
典型案例：
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品種 |
問題 |
| 某品種 |
生物等效性試驗中，該化合物的半衰期40小時，試驗采用雙交叉設計，試驗的清洗期僅為一周，而用藥前取血點的血樣未測定，因此無法判斷清洗期是否足夠，第二周期的血藥濃度是否受到影響。 |
2.試驗數據不可靠：主要表現在由于提供的生物樣本檢測圖譜的真實性和可溯源性存在的問題，導致試驗數據的可靠性無法評價。
3.統計分析方法存在問題，導致試驗的結論不可靠。同時缺少對某些參數的等效性評價，而使試驗的結果分析不具有系統性。
如：未對Tmax進行統計分析
采用置信區間的方法對Tmax進行分析
五、規范性問題：
整體生物等效性試驗以及試驗報告都存在大量的規范性問題，雖然并不構成否定項，但由于規范性問題而對評價帶來很大的障礙，包括試驗起止日期的合理解釋、分析圖譜應包括的信息、試驗數據的表達、統計分析結果的表達等。 | 
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