作者 韋薇、白玉、羅建輝 生物制品藥學(xué)部
藥品穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)藥品有效性和安全性的重要指標(biāo)之一，穩(wěn)定性研究是確定藥品貯藏條件和使用期限的主要依據(jù)，也可以為藥品的生產(chǎn)、包裝、運(yùn)輸條件等提供科學(xué)依據(jù)。對(duì)于藥品，特別是生物制品藥品而言，其活性成分蛋白質(zhì)或多肽的分子構(gòu)型和生物活性的保持都依賴于各種共價(jià)和非共價(jià)的作用力，這些作用力的維持與其所處的微環(huán)境，如溫度、光照、離子濃度和機(jī)械剪切力等存在著密切的關(guān)系，因此生物制品藥物應(yīng)開展嚴(yán)格全面的穩(wěn)定性研究。穩(wěn)定性研究是一個(gè)長期的試驗(yàn)過程，在整個(gè)產(chǎn)品研發(fā)周期中或是產(chǎn)品相關(guān)變更研究中，均是耗時(shí)較長的一項(xiàng)內(nèi)容，因此提前做到全面、準(zhǔn)確、合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)是穩(wěn)定性研究成功的關(guān)鍵。本文擬以生物制品為例，初步探討穩(wěn)定性研究的相關(guān)問題，與業(yè)內(nèi)人士共同交流和探討。
1.為什么要開展穩(wěn)定性研究
生物制品活性成分（API，active pharmaceutical ingredient ）的分子結(jié)構(gòu)中通常含有多個(gè)活性基團(tuán)，這些活性基團(tuán)具有不同的化學(xué)不穩(wěn)定性趨向，經(jīng)常發(fā)生水解、酶解和氧化等化學(xué)過程，從而影響到產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)特性和生物活性等質(zhì)量屬性。因此，常見的穩(wěn)定性研究的目的是為了了解藥品原液或是制劑成品在各種環(huán)境影響因素下質(zhì)量變化情況，特別是變性、失活等重要變化。影響因素包括溫度、濕度和光照等。根據(jù)穩(wěn)定性研究結(jié)果，建立藥品貯存條件（storage conditions）、復(fù)驗(yàn)期（re-test periods）和有效期（expiry date）。穩(wěn)定性研究結(jié)果還可以確定產(chǎn)品生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品制劑處方和包裝材料選擇的合理性，并為產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供試驗(yàn)依據(jù)。
除在產(chǎn)品研發(fā)階段需要進(jìn)行穩(wěn)定性研究，在以下的一些變更情況中也需要開展穩(wěn)定性研究，如：關(guān)鍵工藝步驟、工藝參數(shù)的變更；變更處方或者輔料配比；制劑輔料發(fā)生變更；內(nèi)包裝材料發(fā)生變更；生產(chǎn)地點(diǎn)、車間、生產(chǎn)線的變化；生產(chǎn)規(guī)模變更；增加新規(guī)格產(chǎn)品；變更產(chǎn)品貯藏條件或有效期及其他按照法規(guī)的要求進(jìn)行的合理變更等。通過穩(wěn)定性研究，了解產(chǎn)品的降解途徑、降解速率和降解產(chǎn)物以及聚合條件等情況，以確定各項(xiàng)變更是否會(huì)影響到產(chǎn)品的質(zhì)量，也可為變更的合理性提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
因此，穩(wěn)定性研究是涉及到產(chǎn)品生產(chǎn)工藝、主藥成分、輔料成分、包裝材料、產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定和產(chǎn)品相關(guān)各種變更研究的必不可少的一部分。其研究的結(jié)果反映了產(chǎn)品整個(gè)生產(chǎn)工藝過程和輔助材料的合理性，是直接決定一種藥品是否能夠成為上市產(chǎn)品的關(guān)鍵性研究。
2.穩(wěn)定性研究的考察條件
根據(jù)穩(wěn)定性研究的試驗(yàn)條件，穩(wěn)定性研究可以分為強(qiáng)力破壞試驗(yàn)(影響因素試驗(yàn))、加速穩(wěn)定性試驗(yàn)、長期穩(wěn)定性試驗(yàn)、模擬實(shí)際使用或運(yùn)輸情況穩(wěn)定性試驗(yàn)等[1]。
強(qiáng)力破壞試驗(yàn)是通過建立降解途徑，鑒定可能的降解產(chǎn)物，以確定分子的內(nèi)在穩(wěn)定性，并提示該產(chǎn)品穩(wěn)定性試驗(yàn)的最佳檢測指標(biāo)。強(qiáng)力破壞試驗(yàn)條件通常比加速試驗(yàn)條件更加激烈，主要包括高溫、高濕、強(qiáng)光、反復(fù)凍融、強(qiáng)烈震動(dòng)等。在產(chǎn)品可比性研究中經(jīng)常采用強(qiáng)力破壞性試驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比分析，借助劇烈的試驗(yàn)條件，可以在較短的時(shí)間內(nèi)觀察到產(chǎn)品質(zhì)量的變化，便于分析產(chǎn)品在質(zhì)量和性質(zhì)等方面的異同。
加速穩(wěn)定性試驗(yàn)一般是在較長期穩(wěn)定性研究溫度條件高（一般情況下，至少高15℃），并選擇相適宜的濕度條件下進(jìn)行的。加速試驗(yàn)研究可以為分析方法的驗(yàn)證、降解途徑的闡明、敏感指標(biāo)的確定以及未來開發(fā)工作研究和有效期制定提供依據(jù)。從加速穩(wěn)定性試驗(yàn)中得到的數(shù)據(jù)，可用于估測如在運(yùn)輸期間或使用過程中發(fā)生短期的儲(chǔ)藏條件與標(biāo)簽上規(guī)定不符可能會(huì)造成的影響。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，可能同時(shí)存在多種降解途徑，不同條件下的降解、聚合、變性、失活，以及與內(nèi)包裝容器之間的相互作用變化等穩(wěn)定性情況各不相同，形成的變化產(chǎn)物譜系及其安全性風(fēng)險(xiǎn)程度也不一樣，難以彼此替代，因此僅通過加速降解實(shí)驗(yàn)來預(yù)測生物制品藥物的有效期并不可靠，加速試驗(yàn)結(jié)果僅可以作為復(fù)驗(yàn)期和有效期的輔助依據(jù)。
長期穩(wěn)定性研究是制定原液復(fù)驗(yàn)期和制劑成品有效期的依據(jù)，長期穩(wěn)定性研究的數(shù)據(jù)可以說明產(chǎn)品在復(fù)驗(yàn)期和有效期內(nèi)仍符合其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在長期穩(wěn)定性研究中，任何一項(xiàng)檢測值超出產(chǎn)品的質(zhì)量驗(yàn)收范圍，均視為不合格，產(chǎn)品在效期內(nèi)的檢測項(xiàng)目均應(yīng)符合要求。
模擬實(shí)際使用情況穩(wěn)定性試驗(yàn)一般應(yīng)用于多次使用藥物的研究。一些粉針劑藥物，在開啟并溶解使用后，需要再進(jìn)行保存并進(jìn)行多次取藥。穩(wěn)定性研究中需要模擬實(shí)際使用的情況（包括儲(chǔ)存條件、取樣時(shí)間和取樣量等），對(duì)每次取出樣品進(jìn)行檢定，為藥品保存條件和臨床用藥安全性提供依據(jù)。無菌檢測是該研究中需要重點(diǎn)考察的項(xiàng)目。
穩(wěn)定性研究中考察時(shí)間的長短及放置條件應(yīng)當(dāng)充分考慮到今后的貯藏、運(yùn)輸及其使用的整個(gè)過程。穩(wěn)定性考察時(shí)間的設(shè)置通常為，在規(guī)定的長期試驗(yàn)條件下，第一年每三個(gè)月測一次，第二年每六個(gè)月測一次，以后每年測一次。加速穩(wěn)定性研究和強(qiáng)力破壞性試驗(yàn)一般分別設(shè)置為六個(gè)月和十四天，在此期間若沒有觀察到產(chǎn)品有明顯的降解變化，可以適當(dāng)?shù)难娱L考察時(shí)間。穩(wěn)定性研究中產(chǎn)品的放置情況有正置、倒置和橫放等幾種情況，應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品自身的特點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。
在開展穩(wěn)定性研究過程中，還必須意識(shí)到產(chǎn)品可能會(huì)流通到不同的氣候帶，在研究設(shè)計(jì)中需要有目的地針對(duì)溫度和濕度改變條件。在研究中，針對(duì)已確定的降解產(chǎn)物，應(yīng)開展相關(guān)研究，明確其降解機(jī)理、分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、生物學(xué)活性及其在臨床應(yīng)用中可能造成的影響等。另外，還需要關(guān)注聚合物的形成及帶來的安全性風(fēng)險(xiǎn)。
3.穩(wěn)定性研究的考察項(xiàng)目和采用的方法
目前，沒有一項(xiàng)單一的穩(wěn)定性試驗(yàn)方法或參數(shù)能夠完全反應(yīng)生物制品藥物的穩(wěn)定性特征，因此應(yīng)采用恰當(dāng)?shù)奈锢砘瘜W(xué)、生物化學(xué)和免疫化學(xué)等技術(shù)對(duì)其活性成分（API，active pharmaceutical ingredient ）性質(zhì)進(jìn)行全面的鑒定[2]，考察項(xiàng)目設(shè)計(jì)要全面、合理，應(yīng)包括在貯存時(shí)易變化，且有可能影響產(chǎn)品質(zhì)量、安全性和（或）有效性的考察項(xiàng)目，如外觀、理化性質(zhì)、蛋白純度、蛋白含量、生物學(xué)活性、雜質(zhì)、無菌試驗(yàn)和細(xì)菌內(nèi)毒素等，根據(jù)各檢測項(xiàng)目變化情況對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，其中生物學(xué)活性測定是穩(wěn)定性研究的關(guān)鍵內(nèi)容之一。根據(jù)產(chǎn)品劑型的特點(diǎn)，應(yīng)設(shè)定相關(guān)的考察項(xiàng)目，如粉針制劑應(yīng)考察其水分含量；液體制劑應(yīng)考察其裝量變化情況等。通過分析各個(gè)考察項(xiàng)目隨時(shí)間的變化情況，以達(dá)到了解產(chǎn)品降解途徑和產(chǎn)品敏感的環(huán)境因素。
為了保證穩(wěn)定性研究結(jié)果的真實(shí)可靠，穩(wěn)定性試驗(yàn)的檢驗(yàn)方法應(yīng)經(jīng)過方法學(xué)的驗(yàn)證，包括專屬性、準(zhǔn)確性、精密度、靈敏度等。穩(wěn)定性研究中所使用的儀器，如恒溫箱和恒濕箱等應(yīng)經(jīng)過嚴(yán)格檢查和校驗(yàn)，并應(yīng)定期開展監(jiān)測。在貯藏過程中由于脫氨、氧化、磺酰化、聚合或降解等造成的分子變化，可選用電泳和高分辨率的高效液相層析以及肽圖分析等方法。對(duì)于敏感的檢測項(xiàng)目，可采用多種原理的檢測方法從多個(gè)角度進(jìn)行檢測。如蛋白純度項(xiàng)目的檢測，可采用分子大小異質(zhì)性分析方法、電荷異質(zhì)性分析方法、氧化/疏水性為基礎(chǔ)的分析方法等。
4.穩(wěn)定性研究的考察對(duì)象和考察批次要求
原則上，在產(chǎn)品生產(chǎn)的過程中，凡涉及到不連續(xù)操作的步驟，其中間產(chǎn)物需要儲(chǔ)存的都需要進(jìn)行穩(wěn)定性研究。常見的穩(wěn)定性研究對(duì)象為中間體、原液、半成品和制劑成品。以PEG化長效生物制品為例，中間體在未進(jìn)行PEG化前，常需要收集集中起來并進(jìn)行保存，則此中間體的保存條件需要通過嚴(yán)格的穩(wěn)定性研究結(jié)果來確定。PEG化反應(yīng)及純化分離后獲得的原液，經(jīng)原輔料配比后獲得的半成品、及灌裝和包裝完畢后獲得的制劑成品再分別開展相應(yīng)的穩(wěn)定性研究，以確定其保存條件和復(fù)驗(yàn)期/有效期。成品穩(wěn)定性試驗(yàn)設(shè)計(jì)可以以原液的性質(zhì)、原液穩(wěn)定性研究和處方研究為基礎(chǔ)，制定合理的穩(wěn)定性研究方案。在少數(shù)特殊情況下，產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝從生物體培養(yǎng)（如原核細(xì)胞、真核細(xì)胞等）開始到制劑成品灌裝完成是連續(xù)的、無停頓的，無中間體、原液或是半成品的貯藏步驟，則僅需進(jìn)行制劑成品的穩(wěn)定性研究。
穩(wěn)定性研究批次的一般要求。加速和長期穩(wěn)定性研究中應(yīng)開展至少三批樣品的研究。應(yīng)用于穩(wěn)定性研究的批次產(chǎn)品質(zhì)量應(yīng)具有代表性，生產(chǎn)工藝應(yīng)與正式生產(chǎn)工藝相一致。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生產(chǎn)樣品的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)，可作為輔助性資料，不能作為主要穩(wěn)定性資料[3]。批次的選擇：生產(chǎn)批次的前三批（工藝驗(yàn)證批）應(yīng)進(jìn)行穩(wěn)定性研究，此后至少每年一批原料藥/制劑（除非當(dāng)年沒有生產(chǎn)）需添加到穩(wěn)定性監(jiān)控計(jì)劃中。用于穩(wěn)定性研究的批次需為質(zhì)量檢驗(yàn)后的合格批次。應(yīng)用于制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)的各批次產(chǎn)品應(yīng)源于不同批號(hào)的原液。
規(guī)格不同（濃度不同或裝量不同）的同品種生物制品，在進(jìn)行穩(wěn)定性研究時(shí)，不能簡單的相互替代。最高與最低濃度（或裝量）的同品種制品應(yīng)按照要求進(jìn)行不少于三批產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究，中間濃度（或裝量）制品可依據(jù)不同濃度規(guī)格之間的內(nèi)在聯(lián)系及相互支持適當(dāng)減少研究批次，但是不能漏檢[4]。原液長期穩(wěn)定性試驗(yàn)所用的容器應(yīng)當(dāng)與實(shí)際貯藏和分裝時(shí)的包裝相同或相似；制劑長期穩(wěn)定試驗(yàn)所用容器應(yīng)該按上市時(shí)最終包裝的要求進(jìn)行。
5.穩(wěn)定性研究結(jié)果分析
通過一個(gè)完整的穩(wěn)定性研究，可以更好的了解活性物質(zhì)固有的穩(wěn)定性性質(zhì)，制定合理的制劑處方、保存條件和有效期。產(chǎn)品有效期的制定需綜合多批產(chǎn)品的影響因素試驗(yàn)、加速試驗(yàn)和長期試驗(yàn)等的研究結(jié)果，同時(shí)需結(jié)合藥品在流通過程中可能遇到的情況進(jìn)行全面的分析。
目前，對(duì)于生物制品在有效期內(nèi)的活性降低、物理化學(xué)性質(zhì)變化、降解和聚合產(chǎn)物，尚無分門別類的提出最大可接受降低值的建議，應(yīng)隨不同制品的情況而定，但應(yīng)不低于用于支持上市申請(qǐng)時(shí)的臨床試驗(yàn)代表批次的檢測結(jié)果。對(duì)于定量檢測項(xiàng)目的驗(yàn)收限度，應(yīng)根據(jù)臨床前和臨床研究中所用樣品的總體研究結(jié)果制定可接受的限度，這個(gè)限度應(yīng)包括單個(gè)及總的雜質(zhì)和降解產(chǎn)物的上限，并依據(jù)對(duì)臨床前和臨床試驗(yàn)中所用藥物的雜質(zhì)水平來證明限度的合理性，制品在有效期內(nèi)應(yīng)符合其保證安全和有效的純度和效價(jià)的范圍。不同研究批次的穩(wěn)定性結(jié)果需要進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以確定不同批次樣品之間是否存在顯著性差異，只有在經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析沒有顯著差異的樣品中建立起的有效期才是準(zhǔn)確、可靠的。
穩(wěn)定性研究是貫穿于整個(gè)藥物研究階段和支持藥物上市及上市后研究的重要試驗(yàn)依據(jù)，該項(xiàng)研究資料不僅是法規(guī)的要求，也是藥品安全性有效性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容。穩(wěn)定性考察應(yīng)當(dāng)是科學(xué)思想指導(dǎo)下，經(jīng)過周密設(shè)計(jì)和全面分析研究基礎(chǔ)上，獲知生物制品儲(chǔ)存期間質(zhì)量屬性變化特征的重要過程。以上系作者的分析思考意見，供業(yè)界相關(guān)人士參考。
【參考文獻(xiàn)】
[1] 梅興國主編. 生物技術(shù)藥物制劑-基礎(chǔ)與應(yīng)用.化學(xué)工業(yè)出版社. 2004：73-81.
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[3] ICH Q1a Stability testing of new drug substances and products.2003.
[4] 王軍志主編. 生物技術(shù)藥物研究開發(fā)和質(zhì)量控制.第二版.科學(xué)出版社. 2007：400-402.
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