作者：
殷志勇[1] 王立新[2] 蔣煜[3] 化藥藥學二部
注射劑變更滅菌工藝為較常見的補充申請，當前的申報資料顯示存在如下幾種最常見的變更形式：1、由除菌過濾工藝變更為終端滅菌工藝；2、將殘存概率法滅菌工藝變更為過度殺滅法滅菌工藝；3、由流通蒸汽滅菌變更為殘存概率法或過度殺滅法滅菌工藝。按照《已上市化學藥品變更研究的技術指導原則》，上述變更可能對藥品安全性、有效性和質量可控性產生較顯著的影響，屬于Ⅲ類變更，需進行全面的研究和驗證工作。
本文分析了近期滅菌工藝變更申請中的常見問題，并提出了相應建議，供研究者參考。
問題1：未結合藥物的理化性質對滅菌工藝進行全面的研究
如：對某些穩定性較好，能夠耐受過度殺滅法滅菌的品種，申請人仍采用殘存概率滅菌工藝。某些對溫度比較敏感的品種，部分申報資料僅按照變更后的滅菌條件提供了工藝驗證資料，未提供滅菌條件的篩選信息，包括確定F0值的控制范圍、降解雜質的控制情況。另外在工藝篩選時，未結合滅菌柜驗證的情況考察熱點溫度對樣品的影響。
建議：目前較多申請人根據《關于發布化學藥品注射劑和多組分生化藥注射劑基本技術要求的通知》（國食藥監注[2008]7號）的要求，對注射劑提出滅菌工藝變更申請。
申請人可參考歐盟液體產品滅菌決策樹，并結合產品的特點設計滅菌條件。選擇何種滅菌工藝，首先應取決于被滅菌產品無菌保證水平以及藥物的熱穩定性，而非其他因素，如包裝材料等。只要條件允許，應首選過度殺滅滅菌工藝，主要是因為該工藝的無菌保證安全性非常高，對工藝全過程的控制要求相對較低，只要該藥品是嚴格按照GMP的要求組織生產，即可確保無菌保證值達到≤10-6，而不必擔心裝載的生物負荷和耐熱性。殘存概率滅菌工藝則是從滅菌前微生物污染控制和滅菌過程控制兩方面入手，使得滅菌F0值較低的情況下也能確保達到藥典規定的無菌保證水平。
通常情況下，當產品的熱穩定無法耐受過度殺滅工藝時，可選擇殘存概率滅菌工藝，并且通過對處方工藝（包括滅菌工藝）的優化（某些產品可采用加入抗氧劑、工藝中充氮等方式），最大限度地提高產品滅菌F0值，確保無菌保證水平，同時也最大限度地降低藥物的熱降解。當然，也需注意到，某些產品在提高滅菌溫度但縮短滅菌時間后，產生的雜質可能會有所降低。所以，需結合藥物的具體情況，考察和評價所選滅菌程序對藥物質量的實際影響。
另外，應該注意到，滅菌柜內不同位置的溫度并非完全一致，而是存在一定差異，在對滅菌柜進行驗證時需要對冷熱點的溫差進行控制，如：控制腔室平均溫度與冷點溫度不超過2.5℃或者最高溫度與冷點溫度不超過2.5℃等。因此，滅菌柜內不同位置處的F0值存在波動范圍。例如：如果選擇滅菌條件為121℃，8分鐘，腔室最高溫度與冷點溫度差異2.5℃，在保證冷點F0值為8時，按最大溫差計算，熱點溫度為123.5℃，則熱點處的F0值則會遠遠超出8。在無菌保證滿足要求的前提下，上述溫差對熱穩定產品影響不大，但對熱敏感品種則可能產生顯著影響。因此，在進行工藝研究時則需關注熱點滅菌條件對藥物的影響程度，并研究篩選得到產品的F0值適應范圍（即，設計空間）；在進行熱分布和熱穿透等滅菌工藝驗證時，需注意熱點的F0值應在上述適應范圍之內。同時在工藝驗證或者抽樣檢驗時，對熱敏感產品，也應注意對熱點樣品進行取樣檢驗。上述研究實際上也體現了質量源于設計（QBD）的理念。
當前申報資料顯示申請人在對某些熱敏感藥物進行滅菌工藝篩選時，僅針對最終選擇的滅菌溫度進行了考察，未考察其他溫度條件下對產品的影響。
案例1：某葡萄糖輸液，采用115℃30min滅菌條件，文獻資料顯示滅菌柜內不同部位樣品的5-羥甲基糠醛存在較大差異，其中熱點處樣品的5-羥甲基糠醛超標，提示其滅菌條件篩選或者滅菌柜控制存在缺陷。某申報資料未考察熱點對該產品的影響，也未說明工藝驗證抽樣檢驗時的取樣位置，不清楚是否對熱點處樣品進行了檢驗。
問題2：滅菌工藝驗證與工藝研究信息不一致
如：變更后的滅菌工藝參數（如F0值范圍或熱穿透試驗冷點的F0值）超出滅菌工藝篩選研究的最大F0值，而工藝篩選時顯示該最大F0值對產品的穩定性影響顯著，無法采用。某些申報資料顯示采用殘存概率滅菌工藝，但熱穿透試驗F0值有時能夠大于18、19，而穩定性試驗樣品取樣均未說明取樣點的F0值情況，所提供資料不能反映滅菌工藝變更的合理性。
建議：F0值隨著時間和溫度而累積，而藥物的降解也隨著時間和溫度而累積，這意味著升溫和冷卻程序的變化可影響殺滅時間，影響產品的穩定性，不當的升溫和/或冷卻可能會對F0值存在較明顯的影響。因此，對于某些熱敏感產品，應將升溫與降溫速率作為重要參數進行控制，使滅菌工藝始終符合設計標準。
案例2：某維生素類注射劑，原為流通蒸汽滅菌工藝，現申請將滅菌工藝變更為121℃，10分鐘，屬于殘存概率滅菌工藝，工藝研究顯示不耐受過度殺滅法。滅菌工藝驗證資料顯示存在如下問題：1、熱點F0值最高大于40，冷點的F0值也大于12，遠遠超出殘存概率的滅菌范圍，未考察產品是否可耐受該滅菌條件。2、未抽取熱點樣品，進行檢驗。
問題3：提交的滅菌工藝驗證資料不全面
如：未提供空載熱分布的試驗數據和結果，或僅提供了最小裝載條件的驗證數據和結果，未提供滿載條件下的試驗數據和結果；僅提供一批樣品的數據，未提供三次驗證的數據以及圖譜；驗證試驗所用熱電偶只提供了試驗前校驗結果，未提供試驗后的比對結果；滿載熱分布試驗未提供試驗用樣品的信息，多規格品種驗證不全面，只提供個別規格的試驗數據和結果；未說明生物指示劑挑戰性試驗運行的次數，生物指示劑是否放置冷點處,等。
建議：空載熱分布試驗是滅菌設備驗證的基礎性試驗,主要考察設備性能參數，考察滅菌過程中滅菌柜各個不同位置的溫差狀況，最高溫度和最低溫度的最大波動數據，冷點、次冷點和熱點、次熱點的位置，為下一步的滿載熱試驗提供數據支持。同一個滅菌工藝應至少完整地連續運行三次，以證明滅菌設備的均勻性和重現性。
裝載熱分布試驗方案需根據空載熱分布試驗的結果制定，考察和確定裝載情況下滅菌腔室內溫度分布的均勻性，即裝載物是否對腔室熱分布產生特別影響，導致出現冷點和熱點。應至少進行滿載條件下的熱分布試驗。對熱分布產生影響的主要原因是產品的數量和物理形狀，采用純水代替某些真實的水溶液產品從風險管理角度是可以接受的，但包裝形式應與驗證品種包裝形式相同，多個規格的品種可采用括號法以合理減少試驗運行次數，即選擇最小規格和最大規格的產品進行試驗。應至少連續運行三次完整的滅菌程序。本試驗發現的冷點或熱點為熱穿透試驗需要重點考察的位置。
案例3：某產品的提交的滅菌工藝驗證資料不全面，未提供空載熱分布試驗資料。本品熱分布和熱穿透試驗為最小裝載，未提供滅菌釜的生產能力，未進行滿載條件下熱分布和熱穿透試驗，未進行冷點和熱點的考察和確定。
問題4：熱穿透試驗
如：熱穿透試驗未考慮品種、規格、裝載方式和數量，或用其他品種、規格、包裝形式代替所申報品種，未提供數據支持替代樣品與申報品種熱穿透無差異性。熱穿透試驗的溫度探頭放置位置不符合要求，未進行容器冷點的確定。
建議：應根據滿載熱分布試驗的結果制定熱穿透試驗方案。熱穿透試驗的目的是獲取滅菌柜內不同位置的樣品在滅菌過程中實際達到的溫度和F0值，從而獲取不同位置的樣品之間的溫度和F0值數據，并且掌握樣品內的溫度和F0值與日常生產運行時滅菌設備記錄的溫度和F0值之間的差異。
由于不同品種以及包裝容器的熱穿透性存在差異，熱穿透試驗一般應采用擬申報的品種進行，并明確樣品的批號、批量和裝載方式。如滿載熱分布試驗中發現有冷點或熱點，通常應重點采集該位置的熱穿透數據。
在熱穿透試驗中，溫度探頭應插入待滅菌產品中，插有溫度探頭的樣品的放置位置應包括熱分布試驗確定的冷點和熱點。熱穿透試驗還需關注溫度探頭的安放方式，滅菌過程的最大F0值、最小F0值、平均F0值等。
容器中冷點的確定，容器的冷點是滅菌過程中灌封液體容器中最低F0 的部位。采用冷點建立滅菌程序的方法是一個比較保守的方法，因為它假設容器中所有的微生物都聚集在冷點，且冷點位置的溫度下滅菌。在熱穿透試驗之前，首先需要進行容器的測繪，目的是測定灌入液體的容器中最冷點。對于大容量注射劑，冷點位于產品幾何中心和縱軸的底部，此冷點需要確認。在小容量注射劑，冷點的定位并不典型，因為溶液升溫的速率幾乎與滅菌器相同。冷點的位置也受容器方位的影響。當容器旋轉或搖擺時，可能找不到可辨別的冷點。
作為小容量注射液，如有充分的依據，其熱分布和熱穿透可同時進行。
案例4：某申請人同時申報了十來個不同產品的注射劑變更滅菌工藝，但申報資料均采用了其中一個產品的熱穿透試驗，未提供數據證實替代樣品與申報品種的熱穿透性無差異。
問題5：滅菌前藥液的微生物限度控制要求
采用殘存概率滅菌工藝時，未對滅菌前藥液進行微生物限度控制，未考察污染微生物的耐熱性。或建立了微生物限度控制標準，但檢查的方法不規范，或者未將此標準作為最差條件進行微生物挑戰性試驗。
建議：對殘存概率滅菌工藝而言，產品滅菌前污染微生物量及污染微生物的耐熱性是確定滅菌工藝是否保證足夠無菌保證水平的關鍵因素。應制定微生物中間控制標準，包括滅菌前微生物的污染量和污染菌耐熱性標準，滅菌前樣品的取樣應涵蓋整個生產灌裝的過程，包括灌裝開始、中間和結束階段，同時應注意所抽樣品應與待滅菌樣品在同樣的條件下進行存放。
按照目前的技術要求，對于采用終端滅菌工藝的產品，如采用過度殺滅滅菌法，在驗證工作中應該重點關注熱分布和熱穿透的考察，如采用殘存概率滅菌法，除了考察熱分布和熱穿透以外，還應該關注微生物挑戰試驗和滅菌前微生物負荷的控制。
問題6：微生物挑戰性試驗
如：抗生素、含抑菌劑的品種未考慮品種的抑菌性而直接接種于品種中進行微生物挑戰性試驗。
建議：微生物挑戰試驗的形式通常為將生物指示劑定量加入產品中，制備成帶有確定數量微生物孢子的受試產品，將產品安放在滅菌設備內的特定位置，以盡可能低的滅菌參數（接近擬定的滅菌參數的低限）運行滅菌程序，對受試產品進行無菌檢查，通過計算確定受一定程度微生物污染的產品經滅菌后微生物的殘存概率。為了對液體裝載的生物指示劑進行確認，在密封的、灌封液體的容器和密封件上要接種適當的生物指示劑（BI）。液體介質可以是產品或適當的代用品。如果液體產品含有防腐劑或其他抗生素成分，它們有抑制微生物生長的作用，可能有必要用液體替代品作為懸浮劑。使用何種產品作為懸浮劑需要有試驗數據的支持，證明它們不抑制微生物的生長。
應明確微生物挑戰試驗所采用的生物指示劑的來源、種類、規格（D值與菌數量）、試驗結果，應說明試驗中所采用的生物指示劑的耐熱性及數量對滅菌工藝是否構成必要的挑戰。生物指示劑的耐熱性應大于生產環境和產品中常見污染菌的耐熱性。應根據熱穿透試驗的結果設計試驗方案。若熱穿透試驗證明不同位置的產品間、不同裝載量間、不同裝量規格間的熱穿透特性有顯著差異，應至少選擇滅菌F0值最低的位置、裝載量和裝量規格（即最差條件）進行微生物挑戰試驗。
案例5：某復方電解質葡萄糖注射液變更滅菌條件，工藝驗證時未說明生物指示劑挑戰性試驗運行的次數，生物指示劑是否放置冷點處。
問題7：質量研究和質量標準
如：未關注同品種或同類品種國內外質控要求的進展。
建議：變更滅菌條件多數情況下使藥物面臨更苛刻的環境，可能導致雜質增加、顏色加深等。另一方面，隨著生產條件以及質控要求的提高，國內外藥典對某些產品的質量標準也有所提高，需關注同品種或同類品種國內外質控要求的進展，同時應結合相關指導原則，完善對產品的質控要求。
案例6：某乳酸左氧氟沙星注射液補充申請變更滅菌工藝，由于上市較早，原注冊標準對有關物質控制相對簡單。國內外現行版藥典中與氧氟沙星以及左氧氟沙星相關的品種對雜質控制要求進行了提高，制訂了多種已知雜質、其他雜質和總雜質的限度。應對國內外藥典中左氧氟沙星有關物質方法進行比較，并按雜質指導原則的要求，在有關物質檢查項對結構已知的特定雜質、結構未知的特定雜質、非特定雜質以及總雜質進行分別控制。
問題8：穩定性試驗
如：穩定性試驗未對關鍵指標，如有關物質進行考察，或在申報資料中未提供具體數據，不能充分反映變更前后樣品的質量和穩定性變化情況，不能支持工藝變更的合理性以及滅菌工藝控制的可靠性。
建議：作為提高滅菌溫度的補充申請，建議選取在熱點滅菌的產品進行穩定性考察。設置穩定性研究考察項目時，需選擇能靈敏反應產品質量變化的檢查項目，如：含量、pH值、顏色、有關物質、無菌等檢查項目。
問題9：未關注滅菌溫度對包裝容器的影響
如：變更滅菌條件后未關注塑料包裝是否可耐受新的滅菌條件。
建議：應該注意到，對藥品來說，包裝應具備以下四種特性：保護作用、相容性、安全性與功能性。當前申請人多僅關注了相容性，而忽視了其他特性。某些塑料包裝無法耐受115℃或121℃的滅菌條件，在變更滅菌條件后，需關注包裝材料是否可滿足新的滅菌條件。
案例7：某碳酸氫鈉注射液，變更滅菌條件，采用玻璃包裝，未進行相容性試驗。美國藥典同品種已明確優先選擇中性玻璃，且美國同品種的玻璃容器均為中性玻璃，但是近期也因玻璃質量問題出現兩起召回事件，均為部分藥瓶內含有顆粒物。因此即使采用中性玻璃，仍應進行藥液與玻璃的相容性試驗。
案例8：某注射液變更滅菌條件后采用121℃±1℃、15分鐘滅菌，但所用塑料包材的適應性溫度為115℃30分鐘，二者不相吻合。
問題10：其他
應該注意到，《已上市化學藥品變更研究的技術指導原則》還列舉了其他幾種Ⅲ類變更形式：包括：①用不同操作原理的滅菌柜替代原滅菌柜。②變更滅菌柜的藥品裝載量和裝載方式，且超出原驗證的范疇。③變更除菌過濾過程的濾材種類或孔徑。④使用不同容量的凍干設備替代原凍干設備，或增加不同容量的凍干設備，新的凍干設備與原凍干設備的操作參數和總的生產時間有改變。上述變更同樣可能對藥品安全性、有效性和質量可控性產生較顯著的影響，需進行全面的研究和驗證工作。
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